Tutti abbiamo più o meno chiaro in mente cosa sia un fungo, probabilmente in questo momento starai pensando a un cappello rosso punteggiato di bianco. Giusto, ma un po’ parziale: il regno dei funghi comprende circa 120.000 specie, ma se ne stimano fra i 2,2 e i 3,8 milioni! Benché prima della classificazione dei 5 Regni (proposta da Whittaker nel 1969) questi organismi fossero accomunati alle piante, i funghi presentano delle caratteristiche peculiari che li distinguono da tutti gli altri Regni.
Recenti studi filogenetici dimostrano che, sul piano evolutivo, i funghi sono maggiormente correlati al Regno animale, rispetto al Regno delle piante. Tuttavia, il Regno dei funghi presenta caratteristiche uniche, che lo differenziano rispetto ai due sopracitati. Già a livello di caratteristiche basilari, quale è la modalità di nutrizione, i funghi non compiono fotosintesi (al contrario delle piante, che si servono dell’energia solare per fissare l’anidride carbonica), ma traggono le proprie energie da fonti esterne come gli animali. Tuttavia a differenza degli animali i funghi si nutrono per assorbimento, cioè non vi è un’ingestione delle sostanze nutritive; piuttosto si ha una secrezione di enzimi, volta alla degradazione delle sostanze nutritive, cui segue l’assimilazione.
Per quanto riguarda l’aspetto dei membri di questo Regno, il fungo dell’esempio iniziale rappresenta una porzione dell’intero organismo, il corpo fruttifero, ovvero una delle possibili strutture specializzate che le specie fungine possono costituire, con la finalità di disperdere le spore nell’ambiente e quindi perpetuare la specie.
Tuttavia, il porcino o lo champignon di turno, così come moltissime muffe (da quella del pane, a quelle che crescono sulla superficie di piante, insetti morti, e perfino sui muri delle case) sono accomunati dalla struttura di base dell’organismo, l’ifa. L’ifa è una struttura tubulare caratterizzata da una crescita apicale, contenente protoplasma cellulare più o meno interconnesso, dotata di parete cellulare rigida, contenente polisaccaridi quali chitina e in molti casi il chitosano. L’insieme delle ife costituenti la massa fungina viene detto micelio. La struttura ifale appena vista caratterizza i cosiddetti funghi filamentosi, ma esiste anche un’altra morfologia tipica di questo Regno, quella lievitoide. I lieviti sono funghi a tutti gli effetti, ma sono caratterizzati dall’unicellularità e dalla riproduzione per gemmazione.
c
Prima riga da sinistra: fungo lievitoide del genere Rhodotorula su terreno artificiale; corpo fruttifero di un Basidiomicete, Amanita muscaria ; micelio di Trichoderma su legno. Seconda riga da sinistra: muffa del pane, del genere Rhizopus; lievito Saccharomyces cerevisiae al microscopio elettronico, è visibile la riproduzione per gemmazione; fungo a mensola del genere Pycnoporus su legno senescente.
c
La spiccata plasticità di questi organismi fa sì che riescano a colonizzare i suoli, l’aria, principalmente in forma di spore e frammenti miceliari, le acque dolci e perfino le acque marine. In qualsiasi ambiente siano insediati, i funghi adottano essenzialmente tre tipologie di strategie trofiche:
- Parassitismo (simbiosi patosistica): funghi che si associano ad altri organismi, al fine di soddisfare le proprie esigenze trofiche; l’attività fungina porta a patologie di intensità variabile (in funzione delle caratteristiche ambientali, dell’ospite e del patogeno stesso). Abbiamo funghi patogeni vegetali, dell’uomo (a carico della pelle, per esempio) e degli animali.
- Mutualismo (simbiosi mutualistica): intima associazione della specie fungina con un altro organismo, dalla quale entrambi gli organismi traggono vantaggio. Due esempi classici sono i licheni, frutto della simbiosi fungo-alga e l’associazione micorrizica, che svariate specie fungine stabiliscono con l’apparato radicale vegetale.
- Saprofitismo: attività degradativa condotta sulla materia organica, che viene mineralizzata mediante un pool di enzimi secreti dalle ife fungine. Pensiamo solo alla quantità di materia vegetale prodotta annualmente e quanto l’attività fungina, associata a quella batterica, sia importante nel ciclo del carbonio.
c
Foto di un tartufo nero, al cui interno sono visibili le ife che lo compongono. Questa struttura particolarmente apprezzata in cucina è solo una piccola parte del fungo intero. Infatti gran parte della struttura ifale è impegnata in interazioni simbiontiche, chiamate micorrize, con le radici vegetali (spesso di noccioli).
c
Le biotecnologie fungine
c
Le interazioni che questi organismi sono in grado di intessere negli ambienti naturali, come anche la capacità di nutrirsi utilizzando materiali recalcitranti (pensiamo ai funghi “a mensola” in grado di degradare il legno, o a funghi in grado di degradare sostanze inquinanti nei suoli e nelle acque) ne fanno dei perfetti candidati per una serie di utilizzi nel mondo biotech.
Come abbiamo già visto insieme in “Biotecnologie a tavola: tradizione o innovazione?” i funghi, ed in particolare i lieviti, sono sfruttati da millenni al fine di trasformare substrati alimentari in prodotti finiti (pane, vino, birra, ecc.). Da allora lo sfruttamento a fini alimentari si è perpetrato a oggi, arricchendosi con la coltivazione di specie eduli volta al consumo dei corpi fruttiferi.
Gli avanzamenti sul fronte delle scienze microbiologiche, dal XVIII secolo in poi, hanno portato a caratterizzare i lieviti, così come la struttura ifale caratterizzante moltissimi membri di questo Regno. Ciò ha portato allo sviluppo di alcuni fra i primi esempi di biotecnologie, incentrati sulla coltivazione massiva di lieviti e muffe per la produzione di antibiotici, altri prodotti farmaceutici e non solo.
Infine arriviamo ad oggi, dove l’ingegneria genetica e le tecnologie di genome editing permettono di utilizzare organismi altamente produttivi per la sintesi di molecole di interesse.
Peraltro è fortemente attuale l’approccio dell’economia circolare e i funghi hanno la stoffa per esserne assoluti protagonisti: la spiccata capacità degradativa permette di utilizzare gli scarti di produzione come substrati di crescita, al fine di rendere i processi più sostenibili e aumentare i margini economici.
c
I funghi come biofabbriche
c
Considerazioni preliminari
L’industrializzazione di un processo generalmente necessita di una serie di condizioni affinché quest’ultimo possa risultare efficace: convenienza, tempistiche e prevedibilità sono solo alcune fra la miriade possibili. In ambito biologico il perpetuarsi invariato di un fenomeno è qualcosa di assai raro, una serie di fattori interni ed esterni all’organismo vanno a condizionare il suo comportamento. In un’ottica di messa a punto di un processo di coltivazione di un fungo, volto alla produzione di qualsivoglia composto, questa variabilità non è tollerabile. La messa a punto di un processo biologico su scala laboratoriale è facilmente standardizzabile, giacché basata sull’uso di terreni di coltura preparati con sostanze acquistate in purezza.
Per far si che un processo sia conveniente a livello industriale, spesso occorre, come detto in precedenza utilizzare fonti bio-based, caratterizzate da una variabilità che si ripercuote sulla coltura in atto, gettando incertezza sulla resa percentuale del prodotto desiderato, sul tempo di produzione e altre caratteristiche. Tuttavia è possibile agire su una serie di parametri mediante la messa a coltura in fermentatori.
Si parla di submerged fermentation, che si svolge all’interno di tank generalmente di acciaio inossidabile, areati, agitati da pale, riscaldabili e monitorabili per una serie di parametri, nei quali l’inoculo fungino viene aggiunto nel brodo colturale (composto da acqua, fonti di carbonio, azoto e altri sali minerali, vitamine, ecc.) evitando l’ingresso di contaminanti. In seguito all’inoculo, i funghi, come altri microrganismi, utilizzano i nutrienti nel brodo di coltura compiendo divisione cellulare, nella cosiddetta fase di crescita esponenziale, cui segue una fase stazionaria, in seguito all’esaurimento dei nutrienti, dove la crescita si arresta.
In funzione di queste curve di crescita si sviluppano due strategie fermentative: la coltura in batch, caratterizzata dalla coltivazione dell’organismo, che si esaurisce al terminare dei nutrienti, e la coltura in continuo, caratterizzata da una periodica aggiunta di nutrienti e rimozione di prodotti.
Nella produzione di metaboliti secondari, la prima è la tecnica più adottata giacché generalmente questi ultimi si accumulano in starvation di nutrienti, mentre la coltura in continuo risulta vantaggiosa in termini di produttività per quei prodotti che si formano durante la crescita.
Il brodo colturale a fine ciclo presenta una concentrazione di cellule bassa, generalmente si parla di grammi su litro, quindi diverse tecnologie volte all’allontanamento dell’acqua sono state sviluppate. Le tecniche di processamento a valle del drying variano a seconda del composto di interesse. I passaggi di purificazione di un enzima differiscono da quelli di purificazione di un acido organico.
c
Piccolo bioreattore e schematizzazione interna del funzionamento.
c
Vediamo ora alcuni dei processi industriali nei quali i funghi sono utilizzati come vere e proprie biofabbriche di prodotti.
Acidi organici
I maggiori produttori di acidi organici appartengono senza ombra di dubbio al genere Aspergillus. Nel 1917, James Currie, chimico alimentare, notò che qualsiasi ceppo di Aspergillus niger produceva alte concentrazioni di acido citrico, quando coltivato su mezzi zuccherini. Due anni dopo prese il via il primo impianto di produzione di A. niger e così fecero le biotecnologie industriali. Oggi quella dell’acido citrico è un’industria multimilionaria, con un milione di tonnellate di acido organico prodotte annualmente, che trovano impiego nei settori di cibi e bevande, come acidificante e conservante, oltre che come agente di riduzione della durezza dell’acqua (chelante).
Ceppi di A. niger e Penicillium sono inoltre sfruttati per la produzione di acido gluconico, utilizzato per la pulizia di superfici e la finitura dei metalli, ma anche come additivo di cibi e cementi. L’acido itaconico viene prodotto in coltura sommersa da ceppi di A. terreus e A. itaconicus nutriti con melasse zuccherine e viene utilizzato per la sintesi di svariati polimeri plastici. L’acido kojico è prodotto da ceppi di Aspergillus, come coprodotto, nella fermentazione volta a generare la salsa di soia. Viene inoltre impiegato nell’industria cosmetica come sbiancante della pelle.
Enzimi
I funghi condividono con i batteri la possibilità di essere coltivati in fermentatori, in grado di apportare una serie di benefici, precedentemente evidenziati. Tuttavia, la produzione di enzimi è più favorevole nei modelli fungini rispetto a quelli batterici, per la secrezione degli enzimi stessi nel brodo di coltura, con la conseguente possibilità di ridurre gli step di purificazione. Inoltre, essendo i funghi un modello eucariotico, sono in grado di fornire una serie di modificazioni post-traduzionali conformi alla struttura proteica di enzimi di impiego farmacologico, cosa impensabile in sistemi di espressione batterica.
D’altronde, il mercato degli enzimi prodotti attraverso le fermentazioni supera i 5 miliardi di $ e i funghi vi contribuiscono per più del 50%. La fanno da padrone le idrolasi in tutte le loro declinazioni (cellulasi, amilasi, proteasi, lipasi, a seconda del legame sul quale agiscono). Trovano impiego nell’industria alimentare, del feed, dell’healthcare, del tessile e del conciario, dei detergenti per la pulizia e dei biofuels.
Vediamo ora alcuni casi particolari di applicazione enzimatica.
Le fitasi sono enzimi che trovano impiego nel trattamento dei foraggi cerealicoli e oleaginosi per il bestiame, aumentando il tenore in fosforo della razione alimentare. L’attività enzimatica porta alla liberazione dei fosfati inorganici dall’acido fitico, al quale sono legati e indisponibili.
Le lattasi prodotte dai generi Aspergillus e Kluyveromyces sono utilizzate dalle persone intolleranti al lattosio, per incentivare la digestione del disaccaride. Inoltre queste molecole agiscono della digestione degli antigeni del latte, aspetto importante per la creazione di formule di latte per neonati.
L’azione combinata di proteasi e amilasi è in grado di rimuovere le particelle di sporco dal vestiario, mentre le lipasi agiscono sulle macchie d’olio. La ricerca si sta muovendo per isolare enzimi con elevata attività a basse temperature, così da produrre detergenti più eco-friendly.
Le laccasi sono enzimi in grado di agire sulla degradazione della lignina, recalcitrante polimero, che abbonda nel legno. Non a caso fra i maggiori produttori vi è il genere Trametes, degno rappresentante dei funghi a mensola. La lignina è un annoso problema per l’estrazione della cellulosa da matrici vegetali, specialmente in un’ottica circolare di utilizzo di scarti di potatura. Un classico esempio è l’industria cartaria, che con una serie di trattamenti chimico-fisici, molto impattanti a livello ambientale, va a separare la lignina dalla polpa cellulosica con la quale si produce la carta. A tal proposito l’uso di questi enzimi fungini è caldamente auspicato. Tuttavia, le laccasi fungine trovano applicazione anche nei dentifrici, dove agiscono contro i composti responsabili dell’alitosi.
c
Fungo a mensola del genere Trametes.
c
Infine, pensando a due dei polimeri vegetali più abbondanti, la cellulosa e l’amido, l’uso di amilasi e cellulasi fungine trova applicazione per la rottura dei polimeri, volta alla generazione dei monomeri glucosidici. Questo glucosio può essere utilizzato per una sequela di fermentazioni batteriche e fungine, per la produzione di bioenergia o per la produzione di building blocks per chimica verde.
Single-cell protein e micoproteine
L’elevato contenuto proteico e la velocità di crescita dei lieviti hanno fatto interessare i nostri antenati, negli anni ’60, ad un utilizzo di questi funghi unicellulari come fonte di nutrimento, visti i crescenti tassi di natalità e un’agricoltura non in grado di stare al passo con determinati tassi demografici. Nacque così il concetto di single-cell protein, concentrati di proteine in grado di sopperire alle esigenze alimentari delle nuove generazioni. Tuttavia un disinteresse sui lieviti e la concomitante green revolution, ovvero il miglioramento delle tecniche di breeding in agricoltura, fecero si che il settore primario riuscisse a soddisfare le esigenze della popolazione mondiale.
Tuttavia, Saccharomyces cerevisiae, nutrito con melasse all’interno di fermentatori, è un esempio di single-cell protein, che seppur non consumato dall’uomo è essenziale nella produzione di svariati prodotti alimentari. Inoltre, nei Paesi anglosassoni, esistono prodotti a base di lievito, come la marmite, un prodotto spalmabile molto saporito, derivante dalla lavorazione del residuo di lieviti risultante dalla produzione della birra. La vigemite è un prodotto similare, originario dell’Australia.
Sempre famoso nei Paesi anglosassoni è il Quorn, prodotto surrogato della carne, a base del micelio di Fusarium venenatum. In questo caso si parla di micoproteina, in quanto l’alimento è costituito dall’intero micelio, ossia un insieme di cellule fungine. La coltivazione del fungo avviene in tank alti 50 m, in successione con contenuti di 230 tonnellate di brodo di coltura! Il micelio presenta elevati quantitativi di RNA, potenziale causa di accumulo di acido urico nel sangue, risultante nella gotta e altre patologie. Per prevenire ciò, il micelio viene scaldato per 20 minuti a 68°C, così che gli enzimi endogeni agiscano sulla degradazione dell’acido nucleico, senza intaccare il contenuto proteico. Dopo la separazione dal brodo colturale, il micelio viene miscelato ad albume d’uovo, quindi processato per ottenere colorazione e consistenza paragonabile alla carne.
v
Blocchetti di Quorn.
c
Produzione di antibiotici e altri agenti farmacologici
La storia degli antibiotici C fungini prende il via nel 1928, quando Alexander Fleming scopre la produzione di sostanze in grado di inibire la crescita batterica, da parte di un ceppo di Penicillium rubens. La sostanza prodotta era la penicillina G, facente parte della famiglia degli antibiotici Penicilline, antibiotici β-lattamici che mostrano particolare efficacia sui ceppi batterici gram positivi, grazie all’azione antagonistica nei confronti di proteine associate alla parete cellulare batterica, formata da peptidoglicano.
Le cefalosporine sono un’altra classe di antibiotici β-lattamici isolati dal fungo filamentoso Acremonium chrysogenum. Benché la prima generazione di cefalosporine mostrasse attività contro i batteri gram positivi, l’odierna quinta generazione, ottenuta attraverso la modifica di catene laterali dell’antibiotico mostra maggior attività contro ceppi gram negativi anche antibiotico resistenti, come nel caso dell’azione contro ceppi di Staphylococcus aureus meticillina-resistenti.
Ceppi di Aspergillus terreus e Monascus ruber hanno mostrato produzione di lovastatina, molecola attiva nella riduzione del colesterolo. Questo e altri principi attivi, quali la simvastatina, portano alla sintesi di prodotti farmaceutici con bacini di mercato da miliardi di $.
Gli alcaloidi ergotaminici sono tristemente famosi per la malattia nota come ergotismo o fuoco di Sant’Antonio. Le persone che si alimentavano di pane di segale contaminato, le cui farine contenevano sclerozi (strutture di resistenza fingine) del fungo Claviceps purpurea andavano incontro ad allucinazioni (paragonabili a quelli causati dalla droga LSD), bruciore delle membra, che culminava in fenomeni di necrosi tissutale e portava fino alla morte. Tuttavia, a basse concentrazioni, questi alcaloidi portano ad alleviare il mal di testa, a una riduzione della sintomatologia associata al morbo di Parkinson e a una serie di benefici per le donne partorienti. Tanto gli effetti negativi del fuoco di Sant’Antonio quanto quelli positivi terapeutici, sono frutto dell’interazione di questa classe di neurotrasmettitori con il sistema nervoso, responsabile della contrazione muscolare.
c
Spiga di segale, contaminata dal fungo patogeno Claviceps purpurea. Si può apprezzare lo sclerozio scuro contenete gli alcaloidi.
c
L’approfondimento di oggi si conclude qui, tuttavia non si concludono qui le potenzialità dei funghi a livello biotecnologico. Torneremo in futuro con focus su questo Regno tanto vasto, quanto ricco di potenzialità sul piano economico, ma anche ambientale.
***
Stay tuned!
BGreen team
c
Bibliografia
- Cairns, T. C., Nai, C., & Meyer, V. (2018). How a fungus shapes biotechnology: 100 years of Aspergillus niger research. Fungal biology and biotechnology, 5(1), 13.
- Hawksworth, D. L., & Lücking, R. (2017). Fungal diversity revisited: 2.2 to 3.8 million species. The fungal kingdom, 79-95.
- Mandenius, C. F. (2016). Challenges for bioreactor design and operation. Bioreactors: Design, Operation and Novel Applications.
- Money, N. P. (2016). Fungi and biotechnology. In The fungi (pp. 401-424). Academic Press.